RIPA 即Radio Immunoprecipitation Assay，是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。AboRo的RIPA 裂解液裂解所得的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western 等實(shí)驗(yàn)。主要成分是：50mMTris(pH 7.6)，150mM NaCl，1% TritonX-100，0.5% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS 等多種裂解劑和抑制劑，能有效地抑制蛋白降解。

使用方法

1. 取適當(dāng)量的NCM RIPA Buffer 裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF 的最終濃度為1mM。

注意：NCM RIPA Buffer 不含蛋白酶等抑制劑，根據(jù)需要在使用前添加蛋白酶，磷酸酶等抑制劑。

2. 樣品前處理

（a）對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6 孔板每孔加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2 秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。

（b）對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6 孔板每孔細(xì)胞加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100 萬細(xì)胞/管，然后再裂解。

（c）對(duì)于組織樣品：把組織剪切成細(xì)小的碎片，按照每20mg 組織加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量) ,用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

3. 上述樣品轉(zhuǎn)移至冰上，裂解30 分鐘，中間15 分鐘后補(bǔ)加一次終濃度1mM PMSF。充分裂解后，10000-14000g離心3-5 分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。

注意事項(xiàng)

1.RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA 等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NFκB、p53 等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。

2．為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果，可適當(dāng)分裝使用，以盡量避免反復(fù)凍融。

3．PMSF 應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)加,需自備PMSF，或者可以蛋白酶抑制劑混合物。

4．裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

5．蛋白酶抑制劑均有較高的毒性，為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。4℃保存，室溫運(yùn)輸，一年有效。